1.1 Latar Belakang
Perhatian dan penelitian dalam
bidang sel punca (stem cells)
mengalami kemajuan yang pesat pada dasawarsa terakhir. Para peneliti menggunakan sel punca untuk mengetahui dan mempelajari
proses pertumbuhan dan perkembangan jaringan tubuh manusia serta patogenesis
penyakit-penyakit yang diderita. Sel Punca juga dapat digunakan sebagai
jalan keluar penyakit degeneratif yang bersifat ireversibel sehingga stem cell
merupakan harapan baru bagi terapi kedokteran dimasa yang akan datang. Sel punca
mesenkimal menurut Aggarwal (2005) mampu meningkatkan toleransi
yang dapat mengurangi risiko
graft versus host-disease (GVHD), penolakan (rejeksi) dan
peradangan (inflamasi). Hal
tersebut membuat sel punca
mesenkimal menarik untuk
riset masa depan sejauh
penggunaannya dalam setting
alogenik diperhatikan.
1.2 Rumusan Masalah
1.2.1
Bagaimana karakteristik mesenkimal
stem cell?
1.2.2
Bagaimana teknik isolasi,
kulturisasi, diferensiasi, dan kriopreservasi mesenkimal stem cell?
1.3 Tujuan
1.3.1
Mengetahui karakteristik mesenkimal stem cell
1.3.2
Mengetahui teknik isolasi,
kulturisasi, diferensiasi, dan kriopreservasi mesenkimal stem cell
1.4 Manfaat
Memberikan pengetahuan
bagi penulis dan pembaca mengenai karakteristik mesenkimal stem cell
beserta teknik isolasi, kulturisasi, diferensiasi, dan kriopreservasi dari stem
cell mesenkimal di lembaga penelitian yang berfokus pada sel punca dan
diagnostik kanker, Stem Cell and Cancer Institute (SCI) , PT. Kalbe
Farma.
II. DAFTAR PUSTAKA
2.1 Sel Punca
Sel Punca
atau stem cell adalah sel yang tidak atau belum terspesialisasi dan mempunyai kemampuan atau potensi untuk berkembang menjadi berbagai jenis
sel-sel yang spesifik yang membentuk berbagai jaringan tubuh. Sel Punca mempunyai 2 sifat yang khas yaitu mampu
berdiferensiasi dan mampu memperbanyak diri sendiri. Differentiate yaitu kemampuan untuk berdiferensiasi
menjadi sel lain. Sel Punca mampu berkembang menjadi berbagai jenis sel yang
khas (spesifik) misalnya sel saraf, sel otot jantung, sel otot rangka, sel
pankreas dan lain-lain. Self regenerate atau self
renew yaitu kemampuan untuk
memperbaharui atau meregenerasi dirinya sendiri. Stem cells mampu membuat
salinan sel yang persis sama dengan dirinya melalui pembelahan sel (Jusuf,
2008) .
Menurut Jusuf (2008) berdasarkan pada kemampuannya untuk
berdifferensiasi sel punca dikelompokkan menjadi
a. Totipoten yaitu sel
punca yang dapat berdifferensiasi menjadi semua jenis sel. Yang termasuk dalam
sel punca totipoten adalah zigot dan morula. Sel-sel ini merupakan sel
embrionik awal yang mempunyai kemampuan untuk membentuk berbagai jenis sel
termasuk sel-sel yang menyusun plasenta dan tali pusat. Karenanya sel punca
kelompok ini mempunyai kemampuan untuk membentuk satu individu yang utuh.
b.
Pluripoten yaitu sel punca yang dapat
berdifferensiasi menjadi 3 lapisan germinal (ektoderm, mesoderm, dan endoderm)
tetapi tidak dapat menjadi jaringan ekstraembrionik seperti plasenta dan tali
pusat. Yang termasuk sel punca pluripoten adalah sel punca embrionik (embryonic stem cells).
- Multipoten yaitu sel punca yang dapat berdifferensiasi menjadi berbagai jenis sel misalnya sel punca hemopoetik (hemopoetic stem cells) yang terdapat pada sumsum tulang yang mempunyai kemampuan untuk berdifferensiasi menjadi berbagai jenis sel yang terdapat di dalam darah seperti eritrosit, lekosit dan trombosit. Contoh lainnya adalah sel punca saraf (neural stem cells) yang mempunyai kemampuan berdifferensiasi menjadi sel saraf dan sel glia.
- Unipotent yaitu sel punca yang hanya dapat berdifferensiasi menjadi 1 jenis sel. Berbeda dengan non sel punca, sel punca mempunyai sifat masih dapat memperbaharui atau meregenerasi diri (self-regenerate/self renew) Contohnya erythroid progenitor cells hanya mampu berdifferensiasi menjadi sel darah merah.
2.2 Jenis-jenis Stem Cell
Stem Cell adalah sel yang mampu untuk memperbarui diri
dan berdiferensiasi kedalam bentuk sel yang lain. Menurut sumbernya stem
cell dapat diklasifikasikan kedalam embryonik stem cell dan adult
stem cell yang berisikan hematopoetic, neural crest derived dan
mesenkimal stem cell. Sumber baru dari stem cell telah dibuat,
dikenal dengan induced pluripotent stem cells (Kaebisch, 2014).
Secara garis besar, menurut sifat totipotensinya, stem cell dapat dikategorikan menjadi
dua kategori besar, yaitu stem cell
dewasa (adult stem cells) yang berasal dari sumsum tulang belakang atau
sel darah tepi orang dewasa yang diambil melalui operasi dan stem cell embrionik (embryonic stem cell)
yang berasal dari embrio (janin). Stem cell dewasa memiliki keterbatasan
diferensiasi dalam hal pembentukan tipe sel dibandingkan dengan stem cell
embrionik. Kelompok stem cell dewasa dapat dikelompokkan menjadi tiga
kelompok besar, yaitu stem cell turunan dari sumsum tulang (bone
marrow-derived stem cell), stem cell spesifik di dalam organ,
dan induced pluripotent stem cell
(iPSC) yang disebut juga sebagai stem
cell pluripoten yang dinduksi (diprogram ulang sehingga bersifat seperti
halnya stem cell embrionik).
Selain itu stem cell dari sumsum
tulang dapat dibagi lagi menjadi stem
cell hematopoitik, sel progenitor (prekursor), dan stem cell
mesenkimal (mampu berdiferensiasi menjadi sel penyusun jaringan ikat) (Rachman,
2013).
2.3 Mesenkimal Stem Cell
Stem cell mesenkimal
terdapat di seluruh organ tubuh
terutama di daerah perivaskuler. Terdapat tiga sumber stem cell mesenkimal terbanyak yaitu jaringan adiposa,
darah tali pusat, dan sumsum tulang (Kern, 2006). Stem cell mesenkimal dapat
berdiferensiasi menjadi sel adipogenik, myogenik, kardiomyogenik, kondrogenik,
dan osteogenik. Karakteristik khas stem cell mesenkimal ialah tidak
adanya penanda stem cell hematopoietik. Stem cell mesenkimal dapat mengalami
transdiferensiasi menjadi kardiomiosit dan sel jantung lainnya yang dapat
meningkatkan fungsi jantung serta remodeling melalui pusat pengaturan stromal derived factor
(SDF-1/CXCR-4) (Sardjono, 2009a ). SDF-1 merupakan molekul di permukaan sel stroma sumsum tulang sekaligus
ligan dari CXCR-4 yang terdapat di
permukaan stem cell mesenkimal. Melalui pusat pengaturan
SDF-1/CXCR-4, bila terjadi kerusakan jaringan seperti infark, segera terjadi
migrasi stem cell ke daerah
tersebut yang selanjutnya dapat membantu proses regenerasi sel jantung. Studi
mengenai stem cell mesenkimal ini pertama kali dilaporkan pada
tahun 2001 di Jerman yang dilakukan pada seorang laki-laki yang mengalami
infark miokard. Hasilnya, daerah infark mengecil dengan fraksi ejeksi, indeks
kardiak, dan volume sekuncup naik sebesar 20-30%. Pada studi lainnya, juga
ditemukan peningkatan signifikan dari fungsi jantung setelah dilakukan terapi
(Schuleri, 2002). Banyaknya publikasi itu, membuka wawasan bagi peneliti dan
klinisi dalam mengaplikasikan terapi
stem cell mesenkimal pada pengobatan infark miokard.
Gambar 2.1 Diferensiasi Multilineages
Mesenkimal Stem cell (MSC) dan aditif yang digunakan untuk merangsang
diferensiasi sel (Sardjono, 2009 b)
2.4 Teknik Isolasi, Kulturisasi, Diferensiasi, dan Kriopreservasi Mesenkimal Stem Cell
Sumsum tulang manusia merupakan sumber potensial dari stem
cell mesenkimal. Stroma sumsum tulang merupakan salah satu organ yang
dibentuk oleh stem cell mesenkimal. Oleh karena itu stem cell
mesenkimal seringkali disebut sel stromal multipoten. Secara teoritis, stem
cell mesenkimal terdapat pada seluruh organ tubuh manusia, lebih tepatnya
bagian dari populasi sel yang terdapat di daerah perivaskular. Pertimbangan jumlah
sel, aksesibilitas, dan hasil penelitian yang telah dilakukan maka terdapat
tiga sumber yang paling banyak digunakan untuk mendapatkan stem cell
mesenkimal, yaitu sumsum tulang, darah tali pusat, dan jaringan adiposa. Jumlah
stem cell mesenkimal jaringa adiposa lebih banyak dibandingkan stem
cell mesenkimal dari kedua sumber lainnya. Literatur ilmiah menyebutkan
bahwa persentase isolasi stem cell mesenkimal dari jaringan adiposa
menyamai sumsum tulang yaitu 100%. Isolasi stem cell mesenkimal
pada darah tali pusat sangat sulit dilakukan, sehingga persentase keberhasilan
isolasinya pun hanya berkisar 29-63%. Meskipun demikian, stem cell
mesenkimal yang didapat dari darah tali pusat memiliki potensi proliferasi yang
jauh lebih tinggi, terutama bila dibandingkan stem cell mesenkimal dari
sumsum tulang. Hingga saat ini
karakteristik absolut stem cell mesenkimal masih banyak dipertanyakan,
terutama yang menyangkut model protein permukaan yang terdapat padanya. Sebagai
contoh dari ketidaksesuaian ini adalah keberadaan CD29, CD44, dan CD166 yang
sebenarnya juga banyak dimiliki stem cell mesenkimal. Selain itu stem
cell yang diisolasi dari jaringan adiposa juga menunjukkan ekspresi CD34
dan CD54 pada permukaannya. Dalam hal potensi diferensiasi, sejumlah peneliti juga
melaporkan bahwa stem cell mesenkimal yang didapat dari darah tali pusat
hanya mampu membentuk dua jalur diferensiasi, yaitu kondrogenik dan osteogenik
(Halim, 2010).
Sesuai bentuk
sumbernya, maka langkah awal yang
dilakukan dalam rangka isolasi stem cell mesenkimal dari sumsum tulang
dan darah tali pusat adalah dengan mendapatkan populasi sel mononuklear
terlebih dahulu. Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan senyawa
Ficoll-Hypaque dan berdasarkan prinsip perbedaan gradien antar masing-masing
populasi sel yang terkandung dalam cairan darah. Berbeda dengan hal tersebut
isolasi stem cell mesenkimal dari jaringan adiposa dilakukan dengan
terlebih dahulu melakukan degraasi protein terhadap jaringan kolagen yang
menyelimuti stem cell mesenkimal dalam jaringan adiposa. Degradasi
protein secara enzimatik ini biasanya dilakukan dengan pemberian enzim
kolagenase (Halim, 2010).
Sifat mesenkimal stem
cell yang menempel pada dasar cawan kultur menyebabkan populasi sel
mononuklear yang dikultur dan menempel pada dasar cawan dapat diperkirakan
terdiri dari stem cell mesenkimal. Setelah melewati beberapa kali subkultur,
kemurnian populasi stem cell mesenkimal diperkirakan telah optimal.
Kemurnian ini selanjutnya dapat diuji dan dipastikan kembali dengan menggunakan
Fluorescence activated sel sorting (FACS) yaitu berdasarkan prinsip
keberadaan molekul protein permukaan stem cell mesenkimal (Halim, 2010).
Menurut Halim (2010) sesuai konsensus yang dikeluarkan oleh The
International society of Celluler Therapy, sebuah sel yang tergolong stem
cell mesenkimal harus memiliki karakteristik berikut:
- Bila dikultur dalam sebuah cawan kultur
plastik, maka sel tersebut akan menempel pada permukaan cawan.
- Memiliki molekul permukaan (cluster of
differentiation, CD): CD73, CD90, dan CD105. Berbeda dengan stem cell
hematopoetik, stem cell mesenkimal tidak mengekspresikan CD34, CD14, dan
CD45, serta HLA-DR.
- Mampu berdiferensiasi sesuai tiga jalur
utama diferensiasi mesenkimal, yaitu osteogenik (menjadi tulang/osteosit),
kondrogenik (menjadi sel tulang rawan/kondrosit), dan adipogenik (menjadi sel
lemak/osteogenik).
Dua metode yang paling sering digunakan dalam identifikasi
dan isolasi stem cell dewasa adalah pemisahan sel mononuklear yang
mengandung stem cell, pada darah tepi. Darah tali pusat, dan sumsung
tulang; serta identifikasi dan isolasi stem cell yang terkandung dalam
populasi multiseluler dengan menggunakan Fluorescent activated cell sorting
(FACS) /flowcytometry. Metode yang paling umum digunakan dalam isolasi
populasi sel mononuklear adalah berprinsip sentrifugasi perbedaan densitas (dencity
gradient centrifugation). Medium gradien densitas yang umumnya digunakan
untuk meakukan hal ini adalah Ficoll® -Hypaque®. Ficoll Hypaaque adalah polimer
dekstran yang menginduksi agregasi eritrosit, yang dicampur dengan senyawa
aromatik teriodinisasi untuk meningkatkan osmolaritas dan densitas cairan.
Populasi sel mononuklear dapat diisolasi dengan menggunakan satu lapis medium,
dengan densitas 1,007 g/mL (Halim, 2010).
Teknik ideal dan menjanjikan untuk memperoleh populasi murni
sel yang dikehedaki berdasarkan berbagai parameter yang menunjukkan
karakteristiknya adalah dengan menggunakan flow cytometer. Secara garis
besar flow cytometry terdiri dari tiga sistem yang bekerja secara
seksama, yaitu sistem fluiditik (hidrodinamik), sistem optik dan sistem
konputer. Penanda fluorescent melekat pada reseptor permukaan stem
cell secara spesifik, sehingga stem cell dapat dikenali sebagai sel
yang berpijar saat dikenai sinar laser yang dikeluarkan oleh flow cytometer
(Halim, 2010).
Medium yang biasa digunakan untuk kulturisasi stem cell
mesenkimal adalah α-modified eagle’s medium atau αMEM dan Dulbeco
modified eagle’s medium (DMEM) ke medium tersebut biasanya
ditambahkan L-glutamin, serta hanya mengandung sedikit kadar glukosa. Uji
diferensiasi pada stem cel mesenkimal dilakukan dengan menambahkan
senyawa yang mampu merangsang terjadinya diferensiasi yang diinginkan. Selain
dengan berdiferensiasi stem cell mesenkimal diduga dapat mengatasi penyakit
degeneratif dengan menjadi sel tropik (Halim, 2010).
Simpan beku (kriopreservasi) dapat didefinisikan sebagai sebuah metode
untuk menyimpan sel dalam keadaan inaktif, dengan cara melakukan pendinginan hingga
mencapai suhu dibawah 0oC (subzero), sehingga dapat digunakan
untuk reaktivasi di kemudian hari dengan cara melakukan pencairan. Suhu paling
ideal untuk menyimpan sel dalam waktu yang lama adalah -196oC (dalam nitrogen cair). untuk melindungi sel
dari bahaya kematian, maka krioprotektan selalu ditambahkan pada medium yang
mengandung populasi sel yang dibekukan.
Jenis krioprotektan yang sering digunakan adalah dimethylsulfoxide
(DMSO) dan etilen glikol. Metode yang paling banyak dijadikan standar kriopreservasi
adalah metode pendinginan lambat (slow cooling), pendinginan dilakukan
secara bertahap, sehingga membutuhkan waktu ±90 menit s.d. 5 jam. Namun metode
ini memiliki sejumlah kelemahan. Salah satu alternatifnya adalah metode
vitrifikasi yaitu pendinginan sel berlangsung dengan amat cepat, sehingga
diharapkan sel dan lingkungan sekitarnya didalam medium kriopreservasi berubah
menjadi vitreus atau glassy state
(memiliki tingkat viskositas yang sangat tinggi layaknya kaca) ( Halim,
2010).
2.5 Mekanisme stem cell dalam regenerasi
Homing merupakan aktivitas stem cell untuk
kembali kerumahnya, yaitu jaringan atau organ tubuh yang rusak dan hendak
diperbaiki. Salah satu contoh protein yang berperan dalam rangsang aktivitas
homing stem cell adalah sphingosine 1-phosphate (S1P). Senyawa ini memiliki
reseptor S1P3 yang dimiliki oleh stem cell mesenkimal, sehingga
memungkinkan adanya perlekatan antara keduanya. Interaksi selular tersebut akan
mengarahkan stem cell untuk berdiferensiasi menjadi miofibroblas
sekaligus bergerak menuju ke organ hati yang mengalami fibrosis, setelah stem
cell diadministrasikan secara sistemik atau secara langsung sampai pada
jaringan yang dituju, maka mekanisme regenerasi jaringan yang rusak pun segera
dimulai. Mekanisme perbaikan jaringan yang rusak dengan menggunakan stem
cell terdiri dari dari dua jenis, yaitu diferensiasi stem cell dan
produksi faktor pertumbuhan. Terapi stem cell yang ditujukan untuk
penderita kelainan tulang dan otot paling mungkin menggunakan stem cell
mesenkimal. Hal ini berdasarkan kemampuan stem cell mesenkimal berdiferensiasi
menjadi sel tulang, sel tulang rawan, sel lemak, sel tendon, dan sel stromal
sumsum tulang (Halim, 2010).
Stem cell mesenkimal mampu bertindak sebagai sel tropik dalam
proses hematopoetik dengan memproduksi sejumlah sitokinin dan faktor
pertumbuhan hematopoetik IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, SCF, flt3 ligan
(FL), dan macrophage-colony stimulating factor (M-CSF). Faktor atau
protein penanda homing stem cell mesenkim lainnya yang
berhasil di identifikasi adalah monocyte chemotactic protein-3 (MCP-3)
(Halim, 2010).
III. METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Pelaksanaan kerja praktik dilaksanakan mulai tanggal 02 Februari 2015 – Selesai. Lokasi
kerja praktik adalah Stem Cell and Cancer Institute, PT Kalbe Farma. Jl. Let.
Ahmad Yani No.2, Pulo Mas, Jakarta.
3.2 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan yaitu sterilisator, timbangan
analitik, tabung, cawan atau botol kultur, pipet serologi, syringe , needle,
gelas piala, botol gelas, gelas ukur, hemocytometer, mikropipet, lemari
pendingin 2-8oC, lemari freezer -200oC, APD, pass
box interlock, laminar air flow, inkubator CO2, mikroskop
inversi, sentrifuge..
Bahan-bahan yang digunakan
yaitu populasi stem cell, medium kultur, medium gradien densitas
(Ficoll Hypaque), serum, antibiotik,
antijamur, faktor pertumbuhan, molekul penanda fluorescent, krioprotektan,
senyawa perangsang diferensiasi.
3.3 Cara Kerja
3.3.1 Isolasi
1. Pemisahan sel mononuklear yang mengandung stem
cell, pada darah tepi, arah tali pusat, dan sumsum tulang.
Populasi sel mononuklear
diisolasi dengan menggunakan satu lapis medium Ficoll Hypaque dengan densitas 1,007 g/mL. Setelah darah
tercampur dengan Ficoll Hypaque disentrifugasi dengan kecepatan ±400
g pada suhu ruangan. Kemudian lapisan tipis populasi sel mononuklear yang
berada diantara lapisan plasma dan lapisan Ficoll Hypaque diambil menggunakan
pipet.
2. Identifikasi dan Isolasi stem
cell yang terkandung dalam populasi multiseluler, dengan menggunakan flowcytometry.
Populasi multiseluler diuji
dalam alat flowcytometer dengan penambahan molekul penanda spesifik (fluorescent).
Sel dilewatkan pada aliran cairan isotonik, sinar laser akan mengenainya. Sel
yang diberi label fluorescent (stem cell) akan bermuatan negatif.
Sel bermuatan negatif akan jatuh terpisah sehingga populasi murni stem cell
diperoleh.
3.3.2 Kulturisasi dan Diferensiasi
Medium kultur α-modified eagle’s medium atau αMEM dan Dulbeco
modified eagle’s medium (DMEM) disiapkan dengan penambahan
L-glutamin, dan sedikit glukosa.
Diferensiasi dilakukan
dengan cara medium ditambahkan senyawa yang mampu merangsang terjadinya
diferensiasi yang diinginkan. Medium osteogenik terdiri dari Iscove Modified
Dulbecco’s Medium (IMDM) disuplementasi dengan deksametason, asam askorbat,
gliserol, atau gliserofosfat. Diferensiasi chondrogenik medium yang umum
dipakai terdiri dari Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) tinggi
glukosa disuplementasi dengan deksametason, sodium piofosfat, prolin, Tumor
Growth Factor (TGF) insulin,
transferin, asam seleneic, Bovine Serum Albumin (BSA), dan asam linoleat.
Diferensiasi adipogenik menggunakan IMDM disuplementasi FBS, deksametason,
bovine insulin, 1-metil-3-isobutilamin, dan indometasin. Diferensiasi
neurogenik medium menggunakan IMDM disuplementasi dengan basic Fibroblast
Growth Factor (bFGF), asam retinoat, beta mercaptoethanol (BME), setelah
dicuci dengan medium D-Hanks kemudian ditambahkan DMSO dan beta hidroxy
anisole (BHA). Diferensasi hepatogenik menggunakan IMDM disuplementasi
dengan FBS, penisilin dan streptomisin. Selanjutnya digunakan medium IMDM
disuplementasi FBS, FGF-4, dan penisilin-streptomisin.
3.3.3 Kriopreservasi
Sel didinginkan pada suhu 0oC (subzero) atau -196oC
untuk penyimpanan jangka panjang.
DAFTAR PUSTAKA
Aggarwal S, Pittenger MF. Human mesenchymal stem
cells modulate allogeneic immune
cell responses. Blood . 2005;105:181522.
Halim D, Murti H, Sandra F, Boediono A, Djuwantono T,
Setiawan B. Stem cell-dasar teori & aplikasi klinis. Jakarta:
Penerbit Erlangga; 2010.
Kaebisch C, et al, The role of purinergic receptors in
stemcell differentiation, Comput Struct Biotechnol J (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.csbj.2014.11.003.
Kern S, Eichler H, Stoeve J, Kluter H, Bieback K. Comparative
analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or
adipose tissue. Stem Cells. 2006;24:1294-301.
Rachman, arief. 2013. Stem cell, harapan baru dunia
kedokteran. Smart Living. Ed.45: 62-9.
Sardjono CT, Frisca, Prawiro W, Setiawan B, Sandra F. The
secrets of Stem cell therapy for myocardial infarction. CDK 2009;36:177-9.
Sardjono, CT et al. Application of a modified method for
stem cell isolation from lipoaspirates in basic lab. Medical Journal
Indonesia. 2009;18:92-7.
Schuleri KH, Amado LC, Boyle AJ. Early improvement in
cardiac tissue perfusion due to mesenchymal stem cells. Am J Physiol Heart
Circ Physiol. 2008;294(5):2002-11.
